طراحی وساخت پلاسمید نوترکیب pipigfp با قابلیت بیان ویریونهای hiv-1 به عنوان حامل واکسن

چکیده: ویروس نقص ایمنی انسان (hiv ) از خانواده رتروویریده و عامل سندرم نقص ایمنی اکتسابی(aids) می باشد. تهدیدی که عفونت hiv برای نظام سلامت جهانی ایجاد کرده باعث شده است که مطالعه برای دستیابی به ترکیبات ضد ویروسی جدید و همچنین طراحی و تولید واکسن hiv اهمیت ویژه ای پیدا کند. در این زمینه، استفاده از وکتورهای لنتی ویروسی با توان محدود همانندسازی(scr)، ممکن است نگرانیها را دررابطه با ایمنی زیستی کاهش دهد. در این مطالعه ما با دستکاری یک وکتورscr ویریونی ساخته ایم که ضمن قابلیت تکثیر برای یک سیکل ?قابلیت ورود و بیان پروتئینهای خارجی رانیز داشته و دارای مارکر شناساگر (gfp) باشد. مواد و روشها : پلاسمید pnl4-3 که حاوی ژنوم کامل ویروس hiv است با حذف بخشی از ناحیه rt-in توسط انزیمbali از آن, به پلاسمید scr (pmznl4-3) تغییر یافت. ژن gfp توسط تکنیک pcr از پلاسمید pegfp-n1 تکثیر شد تا علاوه بر جایگاه برش پروتئاز و انزیم محدود کننده bali یک منطقه چند گانه انزیمی (multiple cloning site) در دو انتهای آن ساخته شود بعدازآن درون پلاسمید pmznl4-3 و در چهار چوب توالی ژنrt-in کلون شد . سپس با استفاده از معرف توربوفکت سلولهای hek 293 ترانسفکت گردید و میزان بیانgfp توسط میکروسکوپ فلورسانس و همچنین میزان تولید ویروس از نظر تشکیل سنسیشیوم و اندازه گیری میزان تولید p24 توسط الیزا بررسی گردید. نتایج : پلاسمید pipigfp حامل ژن gfp با جایگاه برش پروتئاز در انتهای 3’ آن ساخته شد ونیز صحت توالی ان تایید گردید ترانسفکت همزمان سلولهای hek293t با پلاسمید pipigfp در کنار پلاسمیدهای pspax2 و pmd2g که به ترتیب gag-pol ویروس hiv و گلیکو پروتئین ویروس وزیکولار استوماتیت را کد می کنند منتهی به بیان gfp و نیز تولید ویریون scr در سوپرناتانت سلولی گردید که قابلیت آلوده ساختن دیگر سلولهای hek293 و انتقال gfp به آنها را داشته است . همچنین نتیجه تست الیزا مبین وجود p24 در سوپرناتانت سلولی بوده است. بحث: یافته های ما نشان داد ویریونهای scr با قابلیت بیان gfp که برای مطالعه در زمینه کشف دارو علیه ویروس hiv به کار می رود بر مبنای ساخته شدن سایت انزیمی در دو سر ژن gfp قرار دارد که در تحقیقات بیشتر این سیستم بتواند با جایگزین کردن gfp توسط آنتی ژن های هدف به عنوان ناقل واکسن به کار رود .